本发明公开了一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列比对结果，通过定点突变技术将原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterproto-phormiae, DSM15035)中D-氨基酸氧化酶的115；119及286三个位点分别突变，构建三点突变表达载体pET-E115A/ N119D/T286A，通过原核表达；纯化获得酶蛋白。所获得的突变蛋白对底物D-Met的表观二级速率常数Kcat/Km为1.39×105s-1·M-1，是野生型DAAO的5.03倍，是猪肾来源的pKDAAO蛋白的55.96倍。可以提高对部分D-氨基酸的检测效率，有较好应用价值。