本发明公开了一种L-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列二级结构比对结果，将假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)的L-丙氨酸脱氢酶活性中心附近73位赖氨酸通过PCR定点突变为丙氨酸，构建突变体表达载体，通过原核表达及Ni-NTA亲和层析技术纯化得到突变体酶K73A。所获得的突变体酶K73A之比活力是野生型的202%，而其他酶学性质没有变化。突变体酶蛋白对底物L-丙氨酸的转换数Kcat为376.7 min-1，对β-NAD+的转换数Kcat为290.1 min-1，分别是野生型的2.0和2.1倍。可用于改善生物法生产丙酮酸及L/D-丙氨酸等的生产工艺。